NGUYÊN TẮC THIẾT KẾ MỒI VÀ MẪU DÒ CHO qPCR
NGUYÊN TẮC THIẾT KẾ MỒI
Mồi có chiều dài từ 18-30 base ( tốt nhất khoảng 24 base)
Hàm lượng GC 40-60%
Base kết thúc của primer tốt nhất là G hoặc C
Tránh cấu trúc thứ cấp (kẹp tóc, self dimer) (Bắt buộc ΔG>-9, nếu ΔG<-9 thì Tm phải cao khoảng trên 60oC)
Tránh lặp lại base C hoặc G hơn 3 lần
Lựa chọn vùng trình tự khuôn tốt nhất để thiết kế primer là khoảng 300-1000 base (vùng dài hơn sẽ yêu cầu phản ứng PCR lâu hơn).
Mồi nên có nhiệt độ bắt cặp từ 55-600C
Kiểm tra trình tự của primer xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung ở đầu 3’(tránh tạo primer-dimer)
Cặp mồi được thiết kế sao cho nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt nhau quá xa
Tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần,thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không được lớn hơn hai G hoặc C tránh hiện tượng nhân bản ký sinh, trình tự mồi phải đặc trưng cho DNA cần nhân bản.
NGUYÊN TẮC THIẾT KẾ MẪU DÒ
Thông thường mẫu dò được thiết kế trước khi thiết kế cặp mồi, cặp mồi được thiết kế gần với vị trí của mẫu dò nhưng không được trùng lắp với mẫu dò. Khi thiết kế mẫu dò cần chú ý các vấn đề sau:
Mẫu dò phải nằm gần primer (để không ảnh hưởng đến quá trình đọc tín hiệu)
Hầu hết mẫu dò có chiều dài ngắn hơn 30 nu
Không nên có G ở đầu 5’ vì G hấp thụ tín hiệu huỳnh quang làm sai lệch kết quả.
Trình tự mẫu dò có hàm lượng GC khoảng 30-80%
Mẫu dò phải có nhiều base C hơn G.
Nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi 8 – 100C.
Tham khảo: Allelic discrimination using fluorogenic probes and the
5% nuclease assay
Kenneth J. Livak *
PE Applied Biosystems, 850 Lincoln Center Dri6e, Foster City, CA 94404, USA
